CIP在環(huán)境中持續(xù)地遷移擴(kuò)散, 當(dāng)達(dá)到一定濃度后會(huì)對(duì)某些敏感微生物的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制, 甚至直接殺死它們, 從而改變土著微生物區(qū)系和數(shù)量, 影響微生物群落結(jié)構(gòu)分布.同時(shí), 環(huán)境中殘留的CIP等氟喹諾酮類抗生素能促進(jìn)抗性基因的產(chǎn)生.目前, 在河流、湖泊、土壤、底泥等不同介質(zhì)中就檢出了由于抗生素作用而產(chǎn)生的抗性基因和耐藥細(xì)菌.抗性基因的傳播和擴(kuò)散可能會(huì)加快抗藥性菌群的大量繁殖, 且細(xì)菌抗藥性一旦生成就很難在短時(shí)間內(nèi)消失， 對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)形成了潛在的威脅.抗性基因作為一種新型污染物, 其危害比抗生素本身要大, 這給人類的身體健康和生態(tài)環(huán)境安全帶來(lái)了不可預(yù)測(cè)的風(fēng)險(xiǎn).近年來(lái), 圍繞著CIP對(duì)水或土壤中微生物群落的影響開(kāi)展了較多的研究, 但大多集中于CIP痕量水平, 關(guān)于高濃度CIP對(duì)活性污泥中微生物群落結(jié)構(gòu)、功能微生物數(shù)量及抗性基因豐度的影響還少有報(bào)道.
Xie等針對(duì)某抗生素生產(chǎn)廢水開(kāi)展研究, 發(fā)現(xiàn)廢水中CIP濃度很高, 達(dá)到5.06 mg ?L-1, 生化處理對(duì)CIP去除效果不佳, 處理出水中殘留濃度仍高達(dá)3.23 mg ?L-1; 且該系統(tǒng)對(duì)有機(jī)物和氨氮去除效果較差, 推測(cè)是廢水中的CIP對(duì)活性污泥中功能微生物造成了影響.此外, 本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)CIP對(duì)膜生物反應(yīng)器運(yùn)行效能會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響.
本研究旨在通過(guò)MBR處理CIP模擬廢水實(shí)驗(yàn), 考察不同CIP投加濃度下MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能微生物豐度的變化; 探討CIP-ARGs, 包括(bāo kuò)gyr
A、gyr
B、parC和parE在CIP選擇壓力下的變化情況, 以期為CIP生產(chǎn)廢水的無(wú)害化處理提供數(shù)據(jù)支撐.
1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)用水
MBR進(jìn)水中含有200 mg ?L-1葡萄糖、256.67 mg ?L-1無(wú)水乙酸鈉(Sodium)、94.17 mg ?L-1硫酸銨和17.50 mg ?L-1磷酸二氫鉀, 其CO
D、氨氮和磷(P)濃度分別約為400、20和4 mg ?L-1.整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)工況, 共運(yùn)行132 d, 運(yùn)行工況1、2、3、4條件下分別向上述MBR進(jìn)水中投加CIP濃度為0、5、10和15 mg ?L-1.所用CI
P、葡萄糖、無(wú)水乙酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀等藥劑均為分析純.
1.2 實(shí)驗(yàn)裝置與運(yùn)行條件
MBR主要由有機(jī)玻璃容器、膜組件和曝氣裝置組成.反應(yīng)器中接種污泥取自某生活污水處理廠好氧膜池, 經(jīng)稀釋水洗和稀釋后, 調(diào)整反應(yīng)器中初始MLSS為6.2 g ?L-1.整個(gè)MBR裝置和進(jìn)水桶采取遮光處理, 避免CIP發(fā)生光解.反應(yīng)器連續(xù)進(jìn)水, 流速為25 mL ?min-1; 間歇抽吸出水, 每連續(xù)出水5 min后停止出水1 min, 以減緩膜污染, 出水流速為30 mL ?min-1.整個(gè)實(shí)驗(yàn)中, 反應(yīng)器水力停留時(shí)間為8 h, 溶解氧為2~4 mg ?L-1, pH為7~8, 水溫為25~30℃, COD容積負(fù)荷約1.2 kg ?-1, 除工況1視情況(Condition)周期性排泥外其余3個(gè)工況幾乎沒(méi)有排泥.
圖 1
圖 1 實(shí)驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)示意
每個(gè)工況下周期性取樣分析常規(guī)水質(zhì)指標(biāo)和CIP的變化情況, 并取污泥樣品密封避光保存于-70℃超低溫冰箱內(nèi), 用于分析微生物群落及其抗性基因的變化.
1.3 分析項(xiàng)目與方法1.3.1 高通量測(cè)序
分別于第33
D、36 d和66
D、69 d和99
D、102 d和132 d采取污泥樣品, 委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序.
泥水混合物3 000 r ?min-1離心去上清液, 沉淀（precipitation）固體部分使用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒進(jìn)行DNA提取, 之后用Qubit®2.0熒光計(jì)檢測(cè)DNA濃度, 用瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA完整性, 用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量.PCR擴(kuò)增采用融合了MiSeq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物341F CCTACGGGNGGCWGCAG)和805R.
1.3.2 抗性基因檢測(cè)分析
采用PowerSoil® DNA Isolation Kit試劑盒并結(jié)合液氮冷凍研磨法對(duì)樣品的基因組DNA進(jìn)行提取.PCR的擴(kuò)增引物如表 1所示.PCR反應(yīng)體系:DNA模板1 μL, 2×Taq酶12.5 μL, 上下游引物各0.5 μL, 10.5 μL ddH2O, 反應(yīng)體系總體積為25 μL.PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)熱5 min, 30個(gè)循環(huán):94℃變性30 s, 退火溫度30 s, 72℃延伸30 s, 最后72℃停留7 min.再采用Universal DNA Purification Kit試劑盒對(duì)CIP-ARGs的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收, 并委托中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量分析.
表 1 引物信息 Table 1 Primer information
1.3.3 其它指標(biāo)（target aim)檢測(cè)
CIP濃度采用高效液相色譜儀HPLC測(cè)定:色譜柱為ODS-2, 5 μm 4.6×250 mm; 檢測(cè)器為紫外可見(jiàn)吸收檢測(cè)器, 波長(zhǎng)為277 nm; 流動(dòng)相為色譜純乙腈:水=20 :80; 流速為0.7 mL ?min-1; 溫度為35℃; 進(jìn)樣體積為10 μL.CO
D、氨氮和MLSS分別采用重鉻酸鉀法、納氏試劑分光光度法和重量法[30]測(cè)定; TOC采用TOC-VCSN總有機(jī)碳分析儀測(cè)定.
2 結(jié)果與討論2.1 不同CIP投加濃度下MBR中微生物群落解析2.1.1 活性污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)
不同CIP投加濃度下MBR污泥中微生物群落在門、綱、目、科、屬等分類水平上的平均種類分布如圖 2所示.門、綱、目、科、屬等5個(gè)分類水平微生物種類數(shù)分布大體上都隨著CIP投加濃度和運(yùn)行時(shí)間的增加呈現(xiàn)減少的趨勢(shì).
圖 2
圖 2 各分類水平微生物群落的數(shù)量分布
在工況1下MBR運(yùn)行穩(wěn)定時(shí), 微生物群落分析中共檢出了17個(gè)門、34個(gè)綱、60個(gè)目、104個(gè)科和232個(gè)屬.
當(dāng)運(yùn)行至工況2, MBR進(jìn)水中CIP濃度為5 mg ?L-1時(shí), 微生物體系突然受到CIP的脅迫, 敏感微生物活性受到抑制而死亡, 使得微生物群落的門、綱和目種類減少; 繼續(xù)運(yùn)行至該階段末, MBR運(yùn)行逐漸趨于穩(wěn)定, 此時(shí)科和屬種類數(shù)相較于0 mg ?L-1時(shí)分別下降了21%和25%.
繼續(xù)增加MBR進(jìn)水中CIP濃度至10 mg ?L-1和15 mg ?L-1, 門和綱水平上微生物種類數(shù)基本趨于穩(wěn)定; 但目、科、屬水平上微生物種類數(shù)卻有較大程度減少, 尤其是屬水平, 工況4末的屬水平種類數(shù)相較于工況1末下降了53%.結(jié)果顯示, CIP的加入對(duì)微生物群落的門和綱數(shù)量影響不大, 但對(duì)目、科、屬數(shù)量影響較大; 表明了微生物分類單位越小, CIP脅迫所引起的微生物種類變化越明顯.
為了深入探究不同CIP濃度對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響, 接下來(lái)分別從門、科、屬水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析.門水平上, MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)分布如圖 3所示.
圖 3
圖 3 門水平上微生物群落結(jié)構(gòu)分布
MBR在工況1中運(yùn)行穩(wěn)定時(shí), 微生物群落共檢出17個(gè)門, 優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門、擬桿菌門、浮霉菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門, 其中變形菌門所占豐度比例最大, 為52%.工況2, MBR進(jìn)水中開(kāi)始投加5 mg ?L-1的CIP, 上述優(yōu)勢(shì)菌群受到CIP的突然沖擊, 其相對(duì)豐度比例呈現(xiàn)出不同程度地降低; 厚壁菌門、放線菌門、Candidatus Saccharibacteria和綠彎菌門為該工況下新增的優(yōu)勢(shì)菌群.
隨著運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng)和CIP投加濃度的繼續(xù)增加, 上述優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度比例呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì):變形菌門和擬桿菌門的相對(duì)豐度比例呈先升高后降低再升高再降低的趨勢(shì), 表明這兩種菌群對(duì)CIP濃度的增加比較敏感; 浮霉菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度比例均呈先增后減的趨勢(shì), 表明這3種菌群能適應(yīng)一定濃度的CIP環(huán)境但在更高濃度的CIP環(huán)境中很難生存; 5 mg ?L-1時(shí)新檢出的優(yōu)勢(shì)菌群均不能適應(yīng)CIP的長(zhǎng)期脅迫而持續(xù)減少, 甚至消失.
在高濃度CIP的長(zhǎng)期選擇性壓力下變形菌門和擬桿菌門成為MBR污泥中的主要菌群, 工況4末二者相對(duì)豐度比例分別為57.5%和12.7%, 表明MBR中大部分抗CIP的微生物是屬于這兩種優(yōu)勢(shì)菌群, 這與前人的研究一致.
科水平上, MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)分布如圖 4所示.
圖 4
圖 4 科水平上微生物群落結(jié)構(gòu)分布
工況1條件下, MBR中檢出的優(yōu)勢(shì)菌科有紅環(huán)菌科、Kofleriacea
E、生絲微菌科、Chitinophagaceae和浮霉菌科, 所占比例分別為15.45%、5.80%、5.67%、16.10%和10.13%;前3者均屬于變形菌門, 后兩者分別隸屬于擬桿菌門和浮霉菌門.工況2, 當(dāng)MBR進(jìn)水中開(kāi)始投加CIP時(shí), 這些優(yōu)勢(shì)菌科活性和生長(zhǎng)受到CIP的抑制, 相對(duì)豐度比例均急劇降低; 而紅桿菌科、消化鏈球菌科和葉桿菌科比例增大, 成為優(yōu)勢(shì)菌科.
當(dāng)MBR在5~15 mg ?L-1的CIP環(huán)境中運(yùn)行期間, 微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同的變化.其中紅環(huán)菌科逐漸適應(yīng)CIP環(huán)境, 相對(duì)豐度比例持續(xù)增加; Kofleriacea
E、Chitinophagaceae和浮霉菌科的相對(duì)豐度比例呈現(xiàn)出先升高后降低再升高再降低的過(guò)程, 表現(xiàn)出波動(dòng)狀態(tài), 表明這3種菌科易受到CIP濃度增加的影響, 其中Chitinophagaceae的變化趨勢(shì)與擬桿菌門完全一致; 生絲微菌科、紅桿菌科、消化鏈球菌科和葉桿菌科相對(duì)豐度比例逐漸降低, 表明這4種菌科經(jīng)不住CIP的長(zhǎng)期脅迫.
面對(duì)高濃度CIP長(zhǎng)時(shí)間的選擇性壓力, 在工況4末期選擇出來(lái)的優(yōu)勢(shì)菌科為紅環(huán)菌科、Chitinophagaceae和叢毛單胞菌科, 相對(duì)豐度比例分別為29.96%、5.44%和6.60%.
屬水平上, MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)分布如圖 5所示.MBR進(jìn)水中未投加CIP時(shí), 污泥中的優(yōu)勢(shì)菌（fungus)屬為Azospir
A、Kofleri
A、Ferruginibacte
R、動(dòng)膠菌屬和生絲微菌屬, 所占比例分別為13.07%、5.80%、10.41%、7.03%和4.48%.工況2, 當(dāng)MBR進(jìn)水中開(kāi)始投加CIP時(shí), 上述優(yōu)勢(shì)菌屬相對(duì)豐度比例均急劇降低, 表明其活性和生長(zhǎng)受到了CIP的抑制; 此時(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬為動(dòng)膠菌屬、Tissierell
A、Acetoanaerobium和Roseicitreum.
圖 5
圖 5 屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)分布
由圖 5可知, 繼續(xù)延長(zhǎng)CIP作用時(shí)間并增加CIP的投加濃度, 微生物群落結(jié)構(gòu)分布產(chǎn)生顯著（striking）性差異.其中Azospir
A、Kofleri
A、Tissierell
A、生絲微菌屬、Acetoanaerobium和Roseicitreum在CIP長(zhǎng)期脅迫下很難生存而失去優(yōu)勢(shì); 而Methyloversatili
S、Ferruginibacte
R、動(dòng)膠菌屬和叢毛單胞菌屬在高濃度CIP的選擇性壓力下成為優(yōu)勢(shì)菌屬, 工況4末各相對(duì)豐度比例分別為21.70%、7.56%、5.24%和4.15%.
門、科、屬水平上的微生物群落結(jié)構(gòu)分析(Analyse)表明, 在高濃度CIP的長(zhǎng)期脅迫和選擇性壓力下, 敏感性微生物活性受到抑制而難以生存; 而變形菌門中紅環(huán)菌科下的Methyloversatili
S、Ferruginibacter和動(dòng)膠菌（fungus)屬及叢毛單胞菌科下的叢毛單胞菌屬最終成為了MBR中的優(yōu)勢(shì)菌屬.
2.1.2 CIP投加濃度對(duì)MBR中微生物群落多樣性的影響
考察CIP投加濃度對(duì)MBR中微生物群落豐富度與多樣性的影響, 結(jié)果如表 2所示.Chao1和ACE指數(shù)用來(lái)估計(jì)微生物群落的豐富度, 而Simpson和Shannon指數(shù)代表群落多樣性.由表 2可知, 隨著MBR進(jìn)水中CIP投加濃度的增加和反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng), Chao1指數(shù)呈下降趨勢(shì), 從0 mg ?L-1的1271.7降至15 mg ?L-1的469.7, 下降率為63%;ACE指數(shù)在整個(gè)運(yùn)行中比較波動(dòng), 但整體上呈下降趨勢(shì); Simpson指數(shù)持續(xù)升高, 而Shannon指數(shù)持續(xù)降低.Chao1、AC
E、Shannon指數(shù)的降低和Simpson指數(shù)的升高表明了MBR污泥中微生物群落受到了CIP的抑制導(dǎo)致部分微生物難以生存而死亡, 使得污泥中微生物群落豐富度和多樣性均呈下降趨勢(shì), 這與圖 2顯示的結(jié)果一致.
表 2 CIP投加濃度對(duì)微生物(Micro-Organism)群落Chao1、AC
E、Simpson和Shannon指數(shù)的影響
2.1.3 CIP投加濃度對(duì)部分功能微生物群落的影響
考察CIP投加濃度對(duì)TO
C、氨氮和CIP去除效果的影響, 淺析污染物去除率變化與微生物群落結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系.結(jié)合圖 5和圖 6可知, 隨著CIP投加濃度從0 mg ?L-1增加到15 mg ?L-1, TOC平均去除率從97.56%下降至90.84%, 表明CIP對(duì)有機(jī)物去除有所影響但影響程度不大.眾所周知, 菌膠團(tuán)是活性污泥和生物膜的重要組成部分, 是有機(jī)物降解去除的主力軍; 動(dòng)膠菌屬作為菌膠團(tuán)的主要構(gòu)成體, 在CIP長(zhǎng)期脅迫下, 其相對(duì)豐度比例趨于穩(wěn)定, 或許TOC去除效果較穩(wěn)定就與之相關(guān).
圖 6
圖 6 CIP投加濃度對(duì)污染物去除率的影響
圖 5顯示, 叢毛單胞菌屬也逐漸成為MBR中優(yōu)勢(shì)菌屬之一, 有研究報(bào)道該菌屬能利用CIP作為碳源[32]; 但在整個(gè)運(yùn)行期間CIP去除率較低, 除了5 mg ?L-1時(shí)主要靠污泥吸附去除59.03%的CIP外, 其余時(shí)段平均去除率僅為7.24%~24.90%, 表明大部分優(yōu)勢(shì)菌種雖可在CIP脅迫下生存和繁殖, 但對(duì)CIP利用率不高.
由圖 6和圖 7可知, 隨著CIP投加濃度的增加和運(yùn)行時(shí)間的延長(zhǎng), 亞硝化單胞菌屬和硝化螺旋菌屬相對(duì)豐度呈先降低后升高再降低的趨勢(shì); 產(chǎn)堿菌屬和硝化桿菌屬持續(xù)減少, 最后消失.這4種菌屬的減少或消失對(duì)MBR中氨氮的篩除造成了負(fù)面影響, 平均去除率由0 mg ?L-1的96.67%降低至15 mg ?L-1的66.52%.雖然硝化微生物對(duì)低濃度CIP可能具有一定的抵抗性和適應(yīng)性, 但在高濃度CIP環(huán)境中硝化微生物卻很難成為優(yōu)勢(shì)菌群, 導(dǎo)致(cause)氨氮的去除效率降低.
圖 7
圖 7 CIP投加濃度對(duì)硝化菌屬的影響
2.2 CIP對(duì)抗性基因的影響
由圖 3~5可知, 在CIP投加濃度為5 mg ?L-1的階段, MBR中微生物在門、科和屬水平上的優(yōu)勢(shì)群落結(jié)構(gòu)分布均存在顯著（striking）性差異.因此選取該階段為研究對(duì)象, 考察CIP-ARGs平均相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化情況, 判斷ARGs水平是否也存在類似現(xiàn)象, 結(jié)果如表 3所示.本研究選取的抗性基因包括DNA促旋酶A亞單位與B亞單位和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的C亞單位與E亞單位.為了最大化減少分析檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)生的誤差, 采用CIP-ARGs的相對(duì)豐度進(jìn)行分析.表 3顯示, CIP的加入對(duì)MBR微生物產(chǎn)生了較為顯著的影響, 其中內(nèi)參基因16S rRNA的絕對(duì)豐度隨CIP暴露時(shí)間的增加總體上呈降低趨勢(shì), 由3.45×107 copies ?g-1降至33 d的1.68×107 copies ?g-1; 4種CIP-ARGs在運(yùn)行3 d時(shí), 相對(duì)豐度均呈現(xiàn)不同程度的降低, 以gyrA基因降低幅度最大, 原因可能是攜帶這4種抗性基因的部分菌種對(duì)高濃度CIP敏感而被殺死.之后隨著運(yùn)行時(shí)間的增加, 這4種CIP-ARGs的相對(duì)豐度呈波動(dòng)狀態(tài), 但相較于CIP投加初期均有所增加, 原因可能在于細(xì)菌長(zhǎng)期暴露在CIP環(huán)境中, 其DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因的抗性決定區(qū)發(fā)生基因突變導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)CIP出現(xiàn)抗性作用, 抗藥性細(xì)菌可能會(huì)逐漸被選擇成為優(yōu)勢(shì)菌群, 這與微生物群落結(jié)構(gòu)分布結(jié)果相一致.
表 3 CIP-ARGs在MBR運(yùn)行中的波動(dòng)變化
3 結(jié)論
通過(guò)(tōng guò)考察不同CIP投加濃度下MBR污泥中微生物(Micro-Organism)群落結(jié)構(gòu)變化發(fā)現(xiàn), 隨著CIP投加濃度和運(yùn)行時(shí)間的增加, 工況4末, 門水平上Proteobacteria和Bacteroidetes仍然為MBR中的優(yōu)勢(shì)（解釋:能壓倒對(duì)方的有利形勢(shì))菌群, 科水平上Rhodocyclacea
E、Chitinophagaceae和Comamonadaceae被選擇成為優(yōu)勢(shì)菌科, 屬水平上Methyloversatili
S、Ferruginibacte
R、Zoogloea和Comamonas被選擇成為優(yōu)勢(shì)菌屬.Chao1、AC
E、Shannon指數(shù)降低和Simpson指數(shù)升高表明MBR中微生物豐富度和多樣性均降低.高濃度CIP對(duì)硝化微生物Nitrosomona
S、Nitrospir
A、Alcaligenes和Nitrobacter的活性具有抑制作用, 導(dǎo)致氨氮去除效果下降.
CIP-ARGs分析表明高濃度CIP的長(zhǎng)期脅迫使得MBR中的gyr
A、gyrB和parC基因增加.
本研究?jī)H為CIP對(duì)MBR中微生物群落結(jié)構(gòu)特征和抗性基因的影響提供數(shù)據(jù)支撐,
